动物疫病检测，作为健康养殖的关键一环，在整体疫病预防控制中发挥着关键作用，具有提前预警评估风险，有效预防和减少疾病的发生等价值。为支持客户精准防控，健康养殖，澳门新葡萄新京6663引进了宋庆庆博士、涂亚斌博士、刘春国博士、李秋博士等一批青年科学家，致力于将更多新颖想法与研究成果融入到产品研发和生产实践中，从而有效带动澳门新葡萄新京6663的技术水平实现不断提高与突破。
近年来，澳门新葡萄新京6663疫病检测实力不断提升，建有CNAS标准实验室，现有30余位检测精英，配备110余台（套）仪器和设备，年检测样本14万余份。在刘春国博士的带领和培养下，澳门新葡萄新京6663检测人才迅速成长，并于近日在国际家禽领域top期刊《家禽科学》上发表了以王雪博士为第一作者，刘春国博士为通讯作者的最新研究成果“同时检测MG ts-11疫苗株和非ts-11株的Cycleave双探针荧光定量PCR方法的开发和应用”（https://doi.org/10.1016/j.psj.2024.103907）。该研究建立的cycleave双探针荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为MG ts-11疫苗株和非ts-11株的快速高效鉴别诊断提供了有力的技术支撑。
以下为论文发表全文
同时检测MG ts-11疫苗株和非ts-11株的Cycleave双探针荧光定量PCR方法的开发和应用
王雪，孙娜娜，王猛，王慧，刘雨涵，石豪，朱浩，李培东，张富友，杨天耀，李朝阳，刘春国
摘要：鸡败血支原体（MG）ts-11活疫苗已成为预防和控制MG感染的有效方法。然而，ts-11株通常难以与非ts-11株，包括野毒株和其他疫苗株（F和6/85）进行区分。因此，建立一种快速有效的方法来区分ts-11株和非ts-11株至关重要。根据ts-11株pot C基因中存在一个单点突变的保守区域，我们设计一对引物及鉴别疫苗毒和野毒的两条探针。该方法能够准确、高效地鉴别ts-11和非ts-11株，最低检测限分别为2.43拷贝/μL和1.6拷贝/μL。此外，该方法也具有良好的特异性，禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、禽腺病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡贫血病毒、马立克氏病病毒、滑液囊支原体和鼻气管鸟杆菌检测结果均为阴性。临床样品检测结果表明，该方法可有效进行ts-11和非ts-11株的混合感染或单一感染的检测区分，而且批内和批间变异系数较低。本研究建立的cycleave双探针荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为MG ts-11和非ts-11株的快速高效鉴别诊断提供了有力的技术支撑。
关键词：鸡败血支原体（MG），cycleave荧光定量PCR，鉴别诊断，ts-11株
引言
目前，已知有约23种支原体存在于鸟类中。其中，最主要和最常见的感染鸡的支原体包括鸡败血支原体（MG）和滑液囊支原体（MS）（Dhondt等，1998; Ross等，2014）。MG是鸡和其他禽类（Wang等，2022）慢性呼吸道疾病（CRD）的主要病原体。由于MG感染后可对家禽养殖业造成重大的经济损失，MG被认为是影响家禽（Mugunthan等，2023）经济价值的最主要的致病性支原体。MG感染呈全球分布，已被世界动物卫生组织（WOAH）所收录。MG可导致火鸡传染性鼻窦炎，北美雀类结膜炎。MG也可引起一些鸟类发病，包括美国金雀、紫雀和麻雀，以及一些观赏性鸟类，包括雉类、鹧鸪和石鸡（Mugunthan等，2023）。在鸡群中，MG不仅引起CRD，还可与大肠杆菌和低致病性禽流感病毒等协同感染，引起呼吸道疾病（Naylor等，1992）。由于MG在禽类中具有较高的致病性，给养殖业造成了巨大的经济损失，因此，提高MG的诊断和防治水平至关重要。
MG可以水平传播和垂直传播。水平传播主要通过飞沫、唾液、携带MG的气溶胶以及被污染的饲料和饮用水；通过鸡胚的垂直传播偶尔发生。鸡群中MG感染很难彻底清除，导致MG感染在鸡群中长期存在并广泛传播，使得MG感染的防控更加困难。
疫苗免疫是预防MG感染的重要策略。目前，6/85、ts-11和F株是世界范围内使用的主要活疫苗株。F菌株毒力强，对肉鸡和火鸡均有致病性。6/85株和ts-11株是非常安全的，对未免疫鸡群的潜在传播风险较低（Noormohammadi and Whithear，2019; Vance等，2008）。ts-11疫苗由澳大利亚生物资源公司研制（Whithear等，1990）。ts-11株的最适生长温度为33℃，相关研究表明在39.5℃时疫苗株增殖能力下降，说明ts-11株对温度敏感。与亲本株（80083株）相比，ts-11株高度致弱，可能对鸡无致病性。此外，ts-11株在鸟类间的水平传播能力也较低。研究表明，ts-11疫苗对MG强毒株引起的呼吸道疾病和产蛋下降具有保护作用（Armour and Ferguson-Noel，2015）。相反，F株能够在肉鸡中传播并引起呼吸道症状（Vance等，2008; Rodriguez and Kleven，1980）。随着ts-11疫苗的广泛使用，区分疫苗株与非疫苗株已成为养殖业的迫切需求。常规的病原体分离培养方法无法有效区分疫苗株和非疫苗株。目前，我国缺乏直接、快速、灵敏和定量的方法来评估疫苗免疫后ts-11株的定植情况（Sulyok等，2019）。因此，建立有效的检测方法来区分MG ts-11株与非ts-11株是控制MG感染的关键。
Cycleave荧光PCR已应用于畜牧业、兽医以及布病和肺癌等人类疾病的研究（Fujita等，2015; Nan等，2016）。该方法不同于传统的荧光定量PCR，它结合循环探针技术提高了特异性。Cycleave PCR检测可以实时检测单核苷酸多态性。利用嵌合RNA-DNA 探针和RNase H来检测目标核苷酸。嵌合探针含有一个RNA碱基，当探针与互补DNA序列形成杂合体时，该碱基可以被RNase H切割，探针裂解发出荧光信号。如果探针的RNA部分或一个RNA碱基与模板不匹配，RNase H 无法切割探针的RNA部分。在本研究中，开发了一种cycleave双探针荧光定量PCR（cycleave qPCR）方法来区分MG ts-11株和非ts-11株。利用RNA和DNA杂合循环探针，RNase H，以及针对性引物，可以高效、准确地鉴别ts-11株和非ts-11株。该方法可在1小时内鉴定出目标株，从而实现MG的快速检测以及ts-11疫苗株与非ts-11株的快速鉴别诊断。
材料与方法
病原
鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、禽腺病毒（FAdV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡贫血病毒（CAV）、马立克氏病病毒（MDV）、MS和鼻气管鸟杆菌（ORT）等均由澳门新葡萄新京6663股份有限公司检测中心保存。所有病毒及MS和ORT均采用特异性PCR方法进行鉴定。
引物和探针
研究表明，pot C基因可作为鉴别ts-11疫苗株与野毒株（Sulyok等，2019）的靶基因。从GenBank下载ts-11株 （CP044225.1）和代表性非ts-11株（野生型（CP006916.3）、6/85（CP044224.1）和F株（NC017503.1））的pot C基因序列。利用Snap Gene软件（version 3.1.4）针对ts-11株pot C基因中含有单点突变的保守区域设计引物。采用金斯瑞qPCR（TaqMan）在线引物设计软件设计探针（https://www.genscript.com/tools/real-timepcr-taqman-primer-design-tool）。所用引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成，见表1。
表1 引物和探针序列
核酸提取及重组质粒的制备
使用VNP-32P全自动核酸提取仪和诺维赞DNA/RNA提取试剂盒提取AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS、ORT和所有拭子样品的核酸。重组质粒pts-11和pnon-ts-11分别克隆有ts-11株和非ts-11株的pot C部分基因，由宝生物工程（大连）有限公司合成。
Cycleave qPCR反应程序
Cycleave qPCR反应体系为25 μL，包括12.5 μL的Cycleave PCR Mix（2×Conc.），上游引物（10 μM）和下游引物（10 μM）各0.5 μL，ts-11探针（5 μM）和非ts-11探针（5 μM）各1 μL，模板2 μL，灭菌水7.5 μL。反应条件为95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共40个循环。延伸时进行荧光信号检测，根据扩增曲线和Ct值判断结果。qPCR使用Roche Light Cycler 480进行。以200 RFU的荧光信号作为cycleave qPCR检测的阈值，Ct≤36判为阳性。
标准曲线的建立
用微量分光光度计测定pts-11和pnon-ts-11重组质粒的浓度，并计算各自的拷贝数。然后将质粒在无菌水中进行10倍倍比稀释（108~103），作为cycleave qPCR的模板。每个稀释度重复3次，建立标准曲线。反应体系和程序同上，利用软件计算标准曲线参数，包括效率、斜率和R2。
特异性、敏感性和重复性分析
为了验证特异性，以提取的AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS和ORT基因组为模板，进行cycleave qPCR扩增。并用104稀释的pts-11和pnon-ts-11质粒作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。
为了检测cycleave qPCR的敏感性，将两个质粒分别做102~1011连续稀释，作为cycleave qPCR和常规PCR的模板，以无菌水作为阴性对照。为了确定cycleave qPCR的重复性和稳定性，将pts-11和pnon-ts-11质粒10倍倍比稀释（104~106）作为cycleave qPCR的模板；在批内和批间重复试验中，每个样品设置3个重复。批间重复试验的时间间隔为1周。根据公式CV =（SD [ Ct值] /总体平均值[ Ct值]）×100计算变异系数（CV）。
临床样品检测
采集2022年山东、黑龙江和广东三省免疫MG ts-11疫苗35天后的10个规模化鸡场的鸡上颚裂拭子300份。样品的采集经澳门新葡萄新京6663股份有限公司实验动物管理与伦理委员会批准（QXRZ：2021-007）。利用建立的Cycleave qPCR方法进行检测，同时与商品化MG通用qPCR试剂盒（英赛特）的检测结果进行比对。此外，从两个饲养和管理条件相似，但MG疫苗免疫程序不同的大型养殖场采集临床样本，以评估免疫效力。
结果
标准曲线的建立
根据检测结果绘制ts-11株和非ts-11株的标准曲线，见图1和表2。斜率分别为-3.303和-3.410，R2值分别为0.9993和0.9987，扩增效率分别为100.8%和98.4%。ts-11株批内重复性CV为0.32%~0.82%，非ts-11株批内重复性CV为0.91%~1.13%。此外，ts-11株批间重复性CV为0.40%~0.51%，非ts-11株批间重复性CV为0.63%~0.95%（表3）。
图1. Cycleave qPCR标准曲线。ts-11株质粒pts-11从2.43×103倍比稀释到2.43×108拷贝/mL（A）；非ts-11株质粒pnon-ts-11从1.65×103倍比稀释到1.65×108拷贝/mL（B）。
表2 Cycleave qPCR标准曲线结果
Cycleave qPCR方法的特异性、敏感性和重复性
选取AIV、IBV、NDV、FAdV、ILTV、IBDV、CAV、MDV、MS和ORT等常见鸡源病原，对建立的cycleave qPCR方法进行特异性验证。结果显示，与阴性对照相同，这些病原cycleave qPCR检测结果均为阴性（图2）。
图2. Cycleave qPCR特异性评估。ts-11疫苗株（A）；非ts-11株（B）。P：阳性对照；A：AIV；B：IBV；C：NDV；D：FAdV；E：ILTV；F：IBDV；G：CAV；H：MDV；I：MS；J：ORT；N：阴性对照。
将质粒进行10倍倍比稀释，根据质粒拷贝数评估cycleave qPCR检测方法的敏感性。结果表明，ts-11株（图3A）和非ts-11株（图3B）的cycleave qPCR敏感性分别为2.43拷贝/μL和1.65拷贝/μL。常规PCR方法对ts-11疫苗株（图4A）和非ts-11株（图4B）的敏感性分别为2.43×103拷贝/μL和1.65×103拷贝/μL。cycleave q PCR方法的敏感性比常规PCR方法高1000倍。
图3. Cycleave qPCR敏感性评估。ts-11株质粒pts-11从102倍比稀释到1010（A）；非ts-11株质粒pnon-ts-11从102倍比稀释到1010（B）。N：阴性对照。
图4. 普通PCR检测ts-11株和非ts-11株电泳图。ts-11株质粒pts-11从102倍比稀释到1010（A）；非ts-11株质粒pnon-ts-11从102倍比稀释到1010（B）。N：阴性对照；M：DNA标准。
为评价cycleave qPCR的重复性和稳定性，进行批内和批间重复性试验，所有cycleave qPCR均重复3次，计算Ct和CV的平均值。结果显示，ts-11株批内重复性CV为0.32%~0.82%，非ts-11株批内重复性CV为0.91%~1.13%。此外，ts-11株的批间重复性CV为0.40%~0.51%，非ts-11株的批间重复性CV值为0.63%~0.95%（表3）。
表3 Cycleave qPCR批内和批间重复性实验结果
临床样品检测
共采集300份免疫ts-11株35天后的鸡上颚裂拭子。ts-11株阳性率为70% （210/300），非ts-11株阳性率为20%（60/300），其余30份检测结果均为阴性，与商品化MG通用qPCR检测试剂盒的结果一致性为100%。
A公司分别在25日龄和45日龄免疫一次ts-11疫苗，B公司仅在21日龄免疫ts-11疫苗。在免疫后不同时间采集上颚裂拭子，利用建立的cycleave qPCR方法评价免疫效果。结果显示，两次免疫的效果（图5A）优于一次免疫的效果（图5B）。
图5. MG ts-11疫苗免疫后不同时间阳性率。A公司在25日龄和45日龄分别免疫一次（A）；B公司在21日龄免疫一次（B）。
讨论
MG ts-11的疫苗于1988年首次在澳大利亚上市，推广20余年，在全球60多个国家应用 (Ley等，1997; Muneta等，2008; Noormohammadi and Whithear, 2019)。该疫苗可持续定植于上呼吸道，阻止野毒株入侵，保护关节和输卵管，提高鸡蛋品质（Vance等，2009 ; Jacob等，2015）。然而，普通方法无法准确区分ts-11株与非ts-11毒株，因此，难以了解MG在鸡群中的流行状态，特别是免疫过MG ts-11疫苗并且发生MG野毒感染的鸡群。由于缺乏准确快速的检测方法，极大地限制了区分疫苗株和非疫苗株、评估临床免疫效果、监测鸡群健康以及预防和控制MG感染的能力。
目前MG的诊断主要依靠分离培养、抗体检测、分子生物学检测 （Feberwee等，2022）。分离培养是检测MG的金标准，但致病性MG是一种生长缓慢且对培养条件相对苛刻的微生物，可能需要长达3周的时间才能检测出来。PCR方法具有特异性强、灵敏度高、快速、简便、价格相对低廉等优点，可用于直接检测临床样本而不需要分离培养（Leurs等，2022）。
为了区分ts-11株和非ts-11株，科学家们进行了许多研究。Raviv等开发了5种qPCR方法，可将3种商品化疫苗株和2种实验室候选疫苗株（F，ts-11，6/85，K5831和K5054）与野毒株（Rlow）进行区分。然而，该方法的适用性有限，无法在更多场合中使用（Raviv等，2008）。DNA指纹图谱分析方法需要纯培养，重复性低，操作步骤冗长，且缺乏实验室间的比对数据（Hong等，2005 ; Naziri等，2016 ; Mateen等，2021）。熔解曲线法和基于琼脂糖凝胶的错配扩增突变检测法（MAMAs），可区分MG疫苗株和野毒株。然而，由于该检测灵敏度适中，DNA载量较低的临床样本可能会产生假阴性结果（Sulyok等，2019）。
因此，需要开发一种简单、快速、灵敏度高、特异性强的检测方法。特别是对于单碱基突变，常规PCR无法进行区分，解决当前的鉴别难题。本研究开发的cycleave qPCR，探针为循环探针，它是一种由RNA和DNA组成的杂合探针，当与RNase H共同使用时，该方法表现出高度灵敏性和特异性。当探针与互补的DNA序列形成杂合体时，可以被RNase H切割，解除淬灭抑制，促进荧光物质发出荧光（Yamada等，2021）。通过测量荧光强度可以实时对产物进行监测。因此，这是一种高度特异性的检测方法，即使只有一个碱基的变化也能识别差异。与传统的荧光PCR相比，该探针一般由大约12个碱基组成，荧光报告基团与淬灭基团接近，淬灭效果好，荧光背景低，信噪比高。
本研究建立的cycleave qPCR方法可在1 h内特异性区分ts-11株和非ts-11株，与AIV、IBV、NDV等常见禽病病原无交叉反应。Cycleave qPCR具有较高的敏感性，对ts-11株的检测极限为2.43拷贝/μL，对非ts-11株的检测极限为1.65拷贝/μL。批内和批间CV均小于1.13%。在临床样品检测中，cycleave qPCR与商品化MG通用qPCR试剂盒的一致性为100%，可有效评价MG ts-11疫苗在鸡群中的免疫效果。需要说明的是，该方法只能区分ts-11疫苗株和非ts-11疫苗株，包括野毒株和其他疫苗株（F和6/85）。如果需要区分疫苗株（包括ts-11、F和6/85）和野生株，建议联合使用其他方法。
综上所述，本研究建立了cycleave双探针荧光定量PCR方法。该方法操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好、效率高。尤其是该方法可以同时检测MG ts-11株和非ts-11株。目前，ts-11活疫苗是主要的MG疫苗，在我国应用广泛，在MG防控的临床实践中发挥了重要作用。Cycleave qPCR的建立将极大地促进MG ts-11活疫苗的应用和MG感染的防控，已在临床上得到证实。在我国，从商品鸡群中根除MG的计划已经提上了日程，本研究建立的cycleave qPCR方法将在MG感染的流行病学监测中发挥重要作用。